Hoechst 33258染色液（Hoechst Stain Solution,10 μg/ml）

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式為C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分子量為533.88，CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低，常用于細胞凋亡檢測，染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33258也用于普通的細胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258和Hoechst 33342相比，Hoechst 33342對細胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細胞時容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來說Hoechst 33258用于細胞固定后再染色，而Hoechst33342則可以對活細胞直接進行染色。

Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm，Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm， 最大發(fā)射波長為461nm。

本Hoechst 33258染色液為即用型，可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色，也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色

● 貯存：

-20℃避光保存，一年有效。

● 操作步驟：

一.固定后的細胞樣品染色：

1. 貼壁細胞：

1.1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)過夜，生長至50%-80%滿度。

1.1.2刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

1.1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

1.1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

1.1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

2.懸浮細胞：

1.2.1 500 g（2400 rpm，下同）離心收集凋亡處理后細胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細胞，常溫固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

1.2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動晃動數(shù)次。

1.2.3 細胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

1.2.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl PBS中。

1.2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟1.2.4染色后細胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā)，可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

二.活細胞染色：

2.1 加入適當量Hoechst33258染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個孔需加入1ml染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。

2.2 在適宜于細胞培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS洗滌2-3次即可進行熒光檢測。細胞發(fā)生凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

三. 實驗示例:

操作流程： 胰酶消化液消化，計數(shù)2×10⁶/ml；500 g 3 min收集1.3 ml 293細胞；細胞沉淀中加入1 ml卡諾固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉淀中加入200 μl Hoechst染色液（10 μg/ml）；37度避光染色10 min； 離心后細胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀察。