非變性裂解液（細胞樣品）
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貨號
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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RL1080
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非變性裂解液（細胞樣品）
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100 ml
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● 產(chǎn)品簡介：
非變性裂解液（細胞樣品）（Native Lysis Buffer for
Cells）是一種用于活性提取哺乳動物細胞的胞漿蛋白、胞核蛋白的提取試劑。本產(chǎn)品與Thermo的M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent（Thermo貨號：78501，78503，78505）以及Sigma的CelLytic M mammalian cell
lysis/extraction reagent（Sigma貨號：C2978）為同類產(chǎn)品，可以考慮平替。
本產(chǎn)品含有一種比較溫和的非變性去垢劑，緩沖系統(tǒng)pH7.6，能夠確保蛋白高效抽提的同時還可以保留蛋白樣品中蛋白或酶的活性，便于進行后續(xù)的蛋白活性分析檢測。
對于使用本產(chǎn)品提取的蛋白溶液，如果希望去除其中的去垢劑，可以通過離心式去垢劑去除柱（貨號：DD0550）快速去除。
本產(chǎn)品提取的蛋白樣品，能較好地保持其原有的空間結(jié)構和生物學活性，可用于蛋白的非變性電泳和多種生物化學和細胞生物學用途。例如，Tris-甘氨酸非變性電泳（貨號：RTD6135，RTD6130）、Blue Native電泳（貨號：RTD6139，RTD6140）、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)，ELISA等常規(guī)生化分析，luciferase、β-gal、alkaline
phosphatase、chloramphenicol
acetyltransferase (CAT)等報告基因(Report
gene)酶活性檢測，PKA、PKC和酪氨酸激酶等蛋白激酶活力的檢測，以及帶有HA、Flag、Myc、V5、His和GST等標簽蛋白的分離純化等方面的用途。
使用本產(chǎn)品獲得的蛋白樣品可用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(貨號：RTP7102)或Bradford蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨號：RTP7104）進行定量分析。由于含有較高濃度去垢劑，不建議使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7101）測定蛋白含量。
本產(chǎn)品裂解液比較溫和，對于膜蛋白提取效果不好，不建議用于膜蛋白提取；由于組織的特殊性，本產(chǎn)品不建議用于組織蛋白的非變性提取。
按照每次裂解5×106細胞，每次使用0.5 ml裂解液，該產(chǎn)品可以提取200個樣品。
● 產(chǎn)品特點：
1. 高效：提取效率比凍融、超聲等方法效率高。
2. 非變性：最大限度保持蛋白活性，不會干擾下游應用。
3. 方便：貼壁細胞可以直接在器皿上裂解，不用刮下細胞。
4. 快速：可在常溫下快速裂解細胞。
● 保存、運輸及效期：
4度保存，常溫運輸，有效期兩年。
● 用前必讀：
1. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。
2. 需自備蛋白酶抑制劑或者購買蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，片劑，通用型)（貨號：PC2930）和/或磷酸酶抑制劑。
● 使用說明：
1. 準備即用型裂解緩沖液：
向預冷的裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑（自備，貨號：PC2930）；如果進行磷酸化研究，還需要加入磷酸酶抑制劑（自備），混勻，冰上預冷待用。
2. 貼壁細胞總蛋白提?。?/b>
2.1 去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照下表直接在培養(yǎng)器皿中加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸，冰上裂解細胞5分鐘，間歇混勻。
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培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
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細胞量
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裂解液推薦使用量
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100 mm培養(yǎng)皿*
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~1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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~2.5×106
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200-400 μl
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24孔板
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~5×105
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100-150 μl
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96孔板
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~1×105
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50-100 μl
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注：100 mm培養(yǎng)皿收集的細胞量~1.5×107（50 mg），可以提取~3 mg總蛋白。
2.2 細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
2.3 4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清。
3. 懸浮細胞總蛋白提?。?/b>
3.1 450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用適量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重復漂洗細胞一次；
3.2 按照細胞沉淀體積（PCM）20 μl（~20 mg）加入200 μl 裂解緩沖液的比例加入裂解液，混勻細胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl（~20 mg），可以提取~1.5 mg總蛋白。
3.3 4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清。
4. 可選步驟：蛋白樣品去除去垢劑：
如果實驗中遇到以下情況，建議進行步驟4。非變性電泳，發(fā)現(xiàn)樣品中的去垢劑導致泳道拖尾；樣品中的去垢劑影響后續(xù)實驗，如ELISA或酶活性測定；樣品中的去垢劑對質(zhì)譜實驗有影響。
4.1去垢劑去除柱（自備，貨號：DD0550）預處理：
4.1.1 取出柱子，放入套管中。
4.1.2 旋開管蓋，不要擰掉柱子底部堵頭，加入0.4 ml 1×PBS，蓋緊管蓋，常溫靜置2 min，活化填料。
4.1.3 擰掉柱子底部堵頭，將柱子放入套管中，1000 g 離心1
min，棄流穿液。
注：離心力不要高于1000 g，過高的離心力會損傷填料，降低去垢劑去除效率。
4.1.4在柱子管蓋上標記填料在柱子內(nèi)的傾斜方向，隨后離心步驟均按同一傾斜方向在離心機內(nèi)放置柱子。
4.1.5柱子中加入0.4 ml 1×PBS，1000 g 離心1min，棄流穿液。至此，柱子活化結(jié)束，備用。
4.2 樣品去垢劑去除：
4.2.1 將柱子轉(zhuǎn)移到2 ml尖底離心管中，加入25-100 μl待處理樣品（樣品濃度高于0.5 μg/μl），常溫靜置2 min。
4.2.2 1000g 離心2 min，收集離心管內(nèi)樣品。
5. 常見問題：
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常見問題
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可能原因
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解決方法
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蛋白提取得率低
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RL1080未能有效裂解細胞膜
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步驟2.2和3.2修改為4度條件下?lián)u床持續(xù)混勻30min。
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RL1080使用量不夠
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加入更多的裂解液
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蛋白表達量低
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優(yōu)化轉(zhuǎn)染程序
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不能提取膜蛋白
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RL1080非變性裂解液僅能提取胞漿蛋白和胞核蛋白
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使用膜蛋白提取專用裂解緩沖液
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● 實驗示例：
實驗程序：
樣品提?。篕562細胞 1×107細胞，400 g 離心3 min收集，1×PBS清洗2次，細胞沉淀中加入0.6 ml
非變性裂解液（貨號：RL1080），輕柔懸浮細胞，4度冰浴15min，間歇混勻，
4度 16000 g 15 min，收集上清。
電泳上樣樣品制備：BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度（貨號：RTP7102），
樣品加入4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114 ），調(diào)配為0.3 μg/μl上樣液，
上樣40 μl（12 μg）。
樣品1：RL1080提取樣品，加終濃度0.125% G-250（5% G-250染料，貨號：BC260）；
樣品2：RL1080提取樣品，不加G-250；
樣品3：RL1080提取樣品使用離心式去垢劑去除柱（貨號：DD0550）去除去垢劑，
樣品4：柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)（貨號:RTD8106）提取樣品；
凝膠制備：Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）（貨號：RTD6140）
制備10% 厚度1.5 mm凝膠；
電泳：使用10×BN電泳緩沖液（貨號：BC500P）。開始電泳用1×藍色BN電泳緩沖液（0.02%G250），
恒壓200 V 51min后，換無色1×BN 電泳緩沖液,電泳時間共104 min
凝膠預處理：凝膠浸泡于1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液+0.1%SDS中 搖床慢搖10 min
濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜：用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：BC600P）配制1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液+20%甲醇，用0.45 μm
PVDF，恒流200 mA（電壓變化114-83 V） 2小時，未冰浴（緩沖液水溫36度）。膜用無水甲醇去除藍色
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020）快速封閉 10 min
GAPDH檢測：GAPDH 兔單抗（貨號：RGA1150） 1:10000 過夜孵育；
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號：HGR1020） RT 1h，ECL 1秒
抗體清除：PVDF膜用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號：WS1200） 清除30min，
Western快速封閉液（貨號：WR5020）快速封閉 10min。
Lamin B1檢測：Anti-Lamin B1抗體（兔單抗）（貨號：RGL1150）1：3000 RT 1h，
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號：HGR1020） RT 1h，ECL 8秒