堿性蛋白非變性PAGE凝膠制備及電泳試劑盒
Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTD6131
|
堿性蛋白非變性PAGE凝膠制備及電泳試劑盒
|
50次
|
● 產(chǎn)品組成：
|
序號(hào)
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
保存條件
|
|
1
|
AC2913-01
|
30%PAA(29:1)
|
100 ml
|
4℃，避光
|
|
2
|
RTD6131-02
|
4×堿性蛋白分離膠緩沖液 pH4.3
|
100 ml
|
4℃
|
|
3
|
RTD6131-03
|
4×堿性蛋白濃縮膠緩沖液 pH6.8
|
50 ml
|
4℃
|
|
4
|
RTD6131-04
|
100×分離膠促凝劑
|
2.5 ml
|
-20℃
|
|
5
|
AP020P
|
APS（干粉）
|
5 ml
|
RT
|
|
6
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃，避光
|
|
7
|
PL110
|
5×甲基綠上樣緩沖液
|
1 ml
|
-20℃
|
|
8
|
TG160P
|
5×堿性蛋白電泳緩沖液（干粉）
|
1 L
|
RT
|
● 產(chǎn)品簡介：
本公司提供的試劑盒包含堿性蛋白凝膠制備及電泳所需的全部試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水。本試劑盒可用于配制堿性蛋白非變性(native)PAGE凝膠。本試劑盒可配制30-50塊常規(guī)大小的非變性PAGE膠。
各種蛋白質(zhì)分子由于所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目不同，因而有各自的等電點(diǎn)。凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)稱為堿性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)偏堿性，如組蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏酸性。分離堿性蛋白時(shí)候，要利用低 pH 凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高 pH 凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的 pH 是 8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)相陽極移動(dòng)；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。
特別說明：
1. 由于本系統(tǒng)采用非連續(xù)凝膠系統(tǒng)，分離膠pH為4.3，因此要求待分離的蛋白等電點(diǎn)pI＞7.0，這樣堿性蛋白在酸性凝膠系統(tǒng)內(nèi)帶正電荷，在凝膠電泳中才能正常向陰極泳動(dòng)。如果待分離的蛋白等電點(diǎn)pI＜7.0，請選擇非連續(xù)Laemmli活性凝膠系統(tǒng)分離（貨號(hào)：RTD6130）。
2. 本試劑盒不適用于總蛋白樣品的電泳，也不適用于總蛋白分離后的Wstern Blot檢測；推薦應(yīng)用于純化后蛋白的堿性蛋白電泳。
● 保存及運(yùn)輸：
按照標(biāo)簽溫度貯存；常溫運(yùn)輸；開封后一年有效。
● 使用說明：
一 配制分離膠
根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度（表一），配制非變性PAGE的分離膠。
表一 不同濃度的PAGE分離膠的最佳分離范圍
|
PAGE分離膠濃度
|
最佳分離范圍
|
|
6%
|
50-150kD
|
|
8%
|
30-90kD
|
|
10%
|
20-80kD
|
|
12%
|
12-60kD
|
|
15%
|
10-40kD
|
配制分離膠前，根據(jù)以下配方準(zhǔn)備10% APS：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少室溫存放時(shí)間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個(gè)月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10% APS。
制備分離膠步驟：
1．根據(jù)下表，將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡
2．在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5
cm的水層，使凝膠表面保持平整。
3．靜置15-30分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
表二 配制不同濃度分離膠所需各組分的體積(毫升)
|
組份
|
6% 分離膠
5 ml
|
8% 分離膠
5 ml
|
10% 分離膠
5 ml
|
12% 分離膠
5 ml
|
15% 分離膠
5 ml
|
|
滅菌水
|
2.7
|
2.4
|
2
|
1.7
|
1.2
|
|
4×分離膠緩沖液 pH4.3
|
1.25
|
1.25
|
1.25
|
1.25
|
1.25
|
|
30％ PAA（29:1）
|
1
|
1.3
|
1.7
|
2
|
2.5
|
|
100×分離膠促凝劑
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
|
TEMED
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
|
10％ APS
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
二 濃縮膠制備：
1．去除覆蓋在分離膠上的水層。
2．按照表三將不同成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
3．將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。
4．將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
5．靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
表三 堿性蛋白Native PAGE濃縮膠(5%)配方表
|
組份
|
5%濃縮膠（2 ml）
|
|
H2O
|
1.15
|
|
4×堿性蛋白濃縮膠緩沖液 pH6.8
|
0.5
|
|
30％ PAA（29:1）
|
0.33
|
|
TEMED
|
0.002
|
|
10％ APS
|
0.02
|
三 電泳：
凝膠凝固好后，根據(jù)以下配方準(zhǔn)備電泳緩沖液。
5×堿性蛋白電泳緩沖液的配制-1 L：將5×堿性蛋白電泳緩沖液干粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，加入冰醋酸11ml，用水定容至1 L，即配成5×堿性蛋白電泳緩沖液（此溶液pH值約為4.4）。
將5×堿性蛋白電泳緩沖液稀釋5倍即配成1×堿性蛋白電泳緩沖液。在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×堿性蛋白電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×堿性蛋白電泳緩沖液。上樣，把電泳電源的電源線互換，即紅色的陽極電極查到陰極孔，黑色的陰極電極插到陽極孔，按照表四條件，電泳，等指示前沿甲基綠電泳到分離膠下緣后，結(jié)束電泳，染色或者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
表四 堿性蛋白電泳條件
|
恒電壓
|
150V
|
|
起始電流
|
30-40mA/板膠
|
|
結(jié)束電流
|
10-20mA/板膠
|
|
電泳時(shí)間
|
40-45分鐘
|
實(shí)驗(yàn)示例：
