明膠酶譜分析試劑盒

      Gelatin Zymography Analysis Kit    Ver.710278

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一種鋅依賴性酶，能切割細(xì)胞外基質(zhì)成分，能在一定條件下水解明膠。細(xì)胞內(nèi)的MMP以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)，參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。

本試劑盒采用酶譜法（Zymography）檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物明膠的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳時(shí)，SDS與樣本中的MMP可逆性結(jié)合，導(dǎo)致MMP氫鍵和疏水鍵被破壞而不能發(fā)揮分解明膠的作用。電泳結(jié)束后取出凝膠與孵育溶液孵育，MMP恢復(fù)活性，在其遷移位置水解凝膠中的明膠，考馬斯亮藍(lán)染色后凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮白色區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及活性，其強(qiáng)弱與MMP活性呈正比。

本試劑盒提供明膠酶譜分析的全套試劑，試劑盒可進(jìn)行50 次標(biāo)準(zhǔn)膠（8×10 cm）檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750 個(gè)樣品。試劑盒配套有膠原酶陽(yáng)性對(duì)照，可以有效分解明膠，方便判斷凝膠及電泳體系是否有問(wèn)題。

● 貯存及運(yùn)輸：

    按照試劑盒標(biāo)簽貯存；常溫運(yùn)輸；開封后試劑盒有效期一年。

● 使用說(shuō)明：

1. 10% APS配制-5 ml：

將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少室溫存放時(shí)間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個(gè)月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10%APS。

2. 10×明膠底物配制：

明膠粉末加入30 ml滅菌水，60℃水浴中徹底融化，冷卻至常溫后使用。明膠底物配制后-20℃貯存。

一 分離膠制備：

1.1參照凝膠模具說(shuō)明書，裝配好凝膠模具。

1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.4靜置5-10分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說(shuō)明凝膠已聚合

二 濃縮膠制備：

2.1去除覆蓋在分離膠上的乙醇層。

2.2按照表格將不同體積成分在一個(gè)小燒杯中混合；最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。

2.4將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

2.5靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合（25℃ 標(biāo)準(zhǔn)凝固時(shí)間為50分鐘）。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)表格標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)催化劑的加入量。

三 電泳：

3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液的配制：

   將一包干粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值，pH 8.3-8.5）。電泳前將緩沖液稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

3.2 樣品處理：融化-混合-上樣

3.2.1 將5×蛋白上樣緩沖液（變性，非還原）常溫融化后混勻。

3.2.2 將上樣緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻。

注：由于MMP活性需要二價(jià)陽(yáng)離子，蛋白樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等。

蛋白樣品提取可以選擇RL0120F RIPA裂解液(強(qiáng)，不含抑制劑，不含螯合劑)

3.2.3 快甩離心收集到管底，常溫放置5-10分鐘，不要加熱處理樣品，上樣電泳。

     膠原酶陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)上樣5-10 μl。

3.3 電泳：

   在電泳槽的內(nèi)槽加入1×電泳緩沖液，輕輕撥出梳子，沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣，恒電壓150 V電泳。

電泳條件（一板膠）

四 MMP檢測(cè)：

4.1 漂洗：

取出凝膠，放入容器內(nèi)，加入50 ml蒸餾水漂洗凝膠，搖床慢搖5分鐘，重復(fù)一次。

4.2 復(fù)性：

4.2.1  1×復(fù)性緩沖液配制：

將10×復(fù)性緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×復(fù)性緩沖液加90 ml蒸餾水。

注：如10×復(fù)性緩沖液由于低溫貯存有析出時(shí)，37℃徹底溶化后再使用。

4.2.2 復(fù)性：

取出凝膠，棄蒸餾水，加入50 ml 1×復(fù)性緩沖液，搖床慢搖30分鐘。

注：復(fù)性結(jié)束后，凝膠呈乳白半透明狀。

4.3 孵育：

4.3.1 1×孵育緩沖液配制：

將10×孵育緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×孵育緩沖液加90 ml蒸餾水。

4.3.2 孵育：

倒掉1×復(fù)性緩沖液，加入50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢搖10分鐘；

     棄1×孵育緩沖液，加入 50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢搖4小時(shí)-過(guò)夜孵育。

注：陽(yáng)性對(duì)照-膠原酶IV通常37℃孵育3-4小時(shí)即可消化凝膠中的明膠。如樣品中MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至過(guò)夜。

4.4 顯色：

4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝膠中加入50 ml蒸餾水，搖床慢搖5分鐘，重復(fù)一次。

4.4.2 棄蒸餾水，加入50 ml FastBlue染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適），搖床上常溫?fù)u動(dòng)30分鐘-2小時(shí)，凝膠大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域；蒸餾水漂洗2-3次，每次5-10分鐘。

4.5 拍照：

     由于考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠背景為藍(lán)色，自然光下拍照效果不好。建議使用凝膠觀察透射燈（貨號(hào)：RT3820）底部打光拍照。

五 實(shí)驗(yàn)示例：

10%分離膠（含明膠底物）

電泳條件：1×TGS 150V 36-12mA 90 min

實(shí)驗(yàn)步驟：

    漂洗：蒸餾水漂洗兩次；

復(fù)性：50 ml 1×復(fù)性緩沖液常溫復(fù)性30分鐘；

              孵育：50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育10分鐘；

              50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育15小時(shí)；

漂洗：蒸餾水漂洗兩次；

              染色：FastBlue染色60分鐘。

明膠酶譜分析試劑盒

使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：

1. [2021 IF=3.5] Salidroside protects against ventilation-induced lung injury by inhibiting the expression of matrix metalloproteinase-9.

Author: Hui Zhang, Wenwen Dong, Siyuan Li, Yunqian Zhang, Zhou Lv, Lu Yang, Lai Jiang, Tao Wu & Yan Wang.

Journal: Pharmaceutical Biology. 2021, VOL. 59, NO. 1, 760–768

Institution： Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Paper link：https://doi.org/10.1080/13880209.2021.1967409

2. [2021 IF=2.73] Synovial mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alleviate chondrocyte damage during osteoarthritis through microRNA-130b-3p-mediated inhibition of the LRP12/AKT/β-catenin axis.

Author: Zhenhua Zeng, Yi Dai, Shuo Deng, Sanbao Zou, Tingyang Dou & Feng Wei.

Journal: Immunopharmacology and Immunotoxicology. Published in 2022

Institution： Department of Pain, the First People's Hospital of Jiashan County, Jiaxing

Paper link：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08923973.2022.2038192

3. [2021 IF=4.5] CXCL13 as a Novel Immune Checkpoint for Regulatory B Cells and Its Role in Tumor Metastasis.

Author: Jun Ren, Tianxia Lan, Ting Liu, Yu Liu, Bin Shao, Ke Men, Yu Ma, Xiao Liang,Yu-quan Wei, Min Luo, and Xia-wei Wei

Journal: The Journal of Immunology Published April 18, 2022

Institution： West China Second Hospital, Sichuan University

Paper link： http://www.jimmunol.org/cgi/doi/10.4049/jimmunol.2100341

4. [2021 IF=5.075] Protective Effects of Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against the Jelly?sh Nemopilema nomurai Envenoming.

Author: Jie Li, Qianqian Wang, Shuaijun Zou, Juxingsi Song, Peipei Zhang, Fan Wang, Yichao Huang , Qian He , and Liming Zhang

Journal: Toxins 2023, 15, 283

Institution： Naval Medical University

Paper link：https://doi.org/10.3390/toxins15040283

5. [2021 IF=4.1] ADAMDEC1 induces EMT and promotes colorectal cancer cells metastasis

by enhancing Wnt/β-catenin signaling via negative modulation of GSK-3β.

Author: Yuna Jia, Xiaoyong Huang, Haiyan Shi, MingMing Wang, Jie Chen, Huahua Zhang, Danyang Hou , Hongmei Jing, Juan Du, Huihui Han, Jing Zhang

Journal: Experimental Cell Research 429 (2023) 113629

Institution：Department of Obstetrics, Affiliated Hospital of Yan’an University

Paper link： https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2023.113629

6. [2021 IF=8.0] Extracellular Vesicles Maintain Blood-Brain Barrier Integrity by the Suppression of Caveolin-1/CD147/VEGFR2/MMP Pathway After Ischemic Stroke.

Author: Yiyang Li, Jiali Chen, Xingping Quan, Ying Chen, Yan Han, Jinfen Chen, Li Yang, Youhua Xu, Xu Shen, Ruibing Wang, Yonghua Zhao

Journal: International Journal of Nanomedicine  2024:19 1451–1467

Institution：University of Macau

Paper link： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38371456/

7. [2022 IF=9.7] Direct contact between tumor cells and platelets initiates a FAK-dependent F3/TGF-β positive feedback loop that promotes tumor progression and EMT in osteosarcoma.

Author: Qianyu Shi, Jiuhui Xu, Chenglong Chen, Xueyu Hu, Boyang Wang, Fanwei Zeng, Tingting Ren , Yi Huang, Wei Guo, Xiaodong Tang, Tao Ji

Journal: Cancer Letters 591 (2024) 216902

Institution：Department of Musculoskeletal Tumor, Peking University People’s Hospital

Paper link： https://doi.org/10.1016/j.canlet.2024.216902

8. [2022 IF=4.6] Crocin’s role in modulating MMP2/TIMP1 and mitigating hypoxia?induced pulmonary hypertension in mice.

Author: Jing Deng, Rui Qi Wei, Wen Mei Zhang, Chang Yu Shi, Rui Yang, Ming Jin，Chunmei Piao

Journal: Scientifc Reports (2024) 14:12716

Institution：Beijing Anzhen Hospital Afliated to the Capital Medical University

Paper link： https://doi.org/10.1038/s41598-024-62900-8