25bp
DNA ladder
● 產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格：
RTM444
50次 (250 μl)
● 產(chǎn)品組成：
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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RTM444-01
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25bp DNA ladder
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50次（250 μl）
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DL070-01
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6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液
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1 ml
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DL020-01
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6×DualColor DNA
loading buffer (雙染料)
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1 ml
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本產(chǎn)品是由8條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準(zhǔn)定量Marker，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大小和含量的分析。8條帶的大小分別為25，50，100，150，200，300，400，500bp。其中200bp
bp條帶為加亮帶，含量為100ng/5μl，其余條帶濃度為50ng/5μl。
本產(chǎn)品為雙鏈DNA
Marker，適用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳，不適用于尿素PAGE電泳。由于片段較小，如使用瓊脂糖分離，建議使用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離。
按照每次上樣5
μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用50次。
● 儲(chǔ)存、效期及運(yùn)輸：
-20℃ 貯存;有效期3年；濕冰運(yùn)輸。
● 使用方法：
一、 TBE-PAGE凝膠分離：
1.1制備凝膠步驟：
1.1.1參照凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
注：25bp DNA ladder適用于配制15%TBE-PAGE膠。
1.1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說(shuō)明凝膠已聚合
表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
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各組份體積（ml）
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最佳DNA分離范圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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0.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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1.1.5去除覆蓋在分離膠上的乙醇；按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合；最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
1.2 電泳：
1.2.1 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
1.2.2 取待測(cè)樣品，加入相應(yīng)體積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 25bp DNA
ladder已經(jīng)含有上樣緩沖液，1
mm厚10齒梳子直接上樣5
μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。
1.2.3 連接電源線，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。200 V穩(wěn)壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達(dá)距離凝膠下沿二分之一位置時(shí)結(jié)束電泳（~50bp），此時(shí)溴酚藍(lán)指示前沿在凝膠下沿邊界（~17bp）。
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PAGE凝膠濃度
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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二甲苯菁
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溴酚藍(lán)
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電泳時(shí)間
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15%
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200 V
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25-30
mA/板膠
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10-18 mA/板膠
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~50 bp
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~17 bp
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35+min
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1.3染色：
1.3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。
1.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用RealSafe類(lèi)染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨號(hào)：GR002）進(jìn)行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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配制量100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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10 μl
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1.3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60 rpm染色30 分鐘。紫外光或藍(lán)光儀下觀察。
二、 瓊脂糖凝膠分離：
2.1 瓊脂糖凝膠制備：
由于片段較小，建議選用高分辨率瓊脂糖（貨號(hào)AR1036）制膠。以下步驟以制備50
ml 3%凝膠為例：
稱(chēng)取1.5
g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50
ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重復(fù)1-2次至瓊脂糖完全溶解，無(wú)可見(jiàn)顆粒。倒入制膠容器中，插好梳子，常溫凝固30-50分鐘至凝膠完全凝固。
2.2 電泳：
取待測(cè)樣品，加入相應(yīng)體積6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 25bp DNA
ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。
建議電泳條件：凝膠濃度為3％，電泳電壓8-10
v/cm（單位電壓指電泳槽陰陽(yáng)極之間的距離電壓，如陰極陽(yáng)極之間的距離為20 cm，可以用160-200
V電壓進(jìn)行穩(wěn)壓電泳），待溴酚藍(lán)指示前沿距離凝膠末端2 cm時(shí)終止電泳，電泳時(shí)間35-40分鐘。
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瓊脂糖濃度
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電泳緩沖液
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二甲苯菁
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溴酚藍(lán)
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單位電壓
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電泳時(shí)間
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3%
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1×TAE
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~1000 bp
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~100 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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1×TBE
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~700 bp
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~60 bp
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8-10 V/cm
|
40min+
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2.3觀察條帶。
注：使用EB或Goldview染料時(shí)，由于染料本身帶正電荷較多，隨著電泳時(shí)間的延長(zhǎng)，染料會(huì)向陰極聚集，導(dǎo)致小片段核酸結(jié)合的染料含量降低，會(huì)出現(xiàn)小片段的DNA片段紫外燈下亮度變?nèi)趸虿豢梢?jiàn)。此時(shí)可以將膠浸泡于含有染料的電泳緩沖液中染色15-20分鐘即可看到小片段。使用RealSafe類(lèi)染料可以直接觀察條帶。
2.4 實(shí)驗(yàn)示例：
