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單鏈RNA Marker

單鏈RNA Marker

產(chǎn)品編號:RTM505

產(chǎn)品規(guī)格:25次

數(shù)量
價格 ¥800

單鏈RNA Marker15-50 nt

 

● 產(chǎn)品編號及規(guī)格:

貨號

名稱

規(guī)格

貯存

RTM505-01

單鏈RNA Marker15-50 nt

60 μl

-20℃

RTM505-02

2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)

1 ml

-20

● 產(chǎn)品簡介:

單鏈RNA  Marker由不同長度的單鏈RNA分子混合而成,5條帶的大小為15,20,25,30, 40,50 nt。樣品保存在 TE緩沖液中,每條帶濃度約為100 ng/μl(配成即用型RNA Marker后,每條帶的濃度約為50 ng/μl)。使用前與等體積2×RNA上樣緩沖液混合即可上樣電泳。該Marker適用于跑尿素變性膠,電泳后可以使用核酸染料如RealSafe Red(貨號:GR002)或RealSafe All(貨號:GR004)均可以染色得到清晰的條帶分離效果。

產(chǎn)品內(nèi)附帶2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)。以每次上樣5 μl計算,混合好的單鏈RNA Marker可以使用大約25次。

●  保存條件和運輸:

-20℃貯存,有效期24個月;濕冰運輸。

● 使用方法:

注:以下使用方法均以8×10cm凝膠 1.0mm示例,其他規(guī)格凝膠請適當(dāng)調(diào)整。

. 凝膠制備:

1.1 可以選擇RNA尿素PAGE電泳試劑盒(Cat:RTE4103))或按照以下程序制膠。

1.2.分離膠配制:根據(jù)表格一,將不同體積的成分混合,漩渦攪拌至尿素徹底溶解。

表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,適用于厚度1.0 mm小板膠)

RNA長度

最佳凝膠濃度

尿素()

40%PAA

29:1

10×TBE

RNase-free

10%APS

TEMED

200-1000 nt

5%

2.1

0.625 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

50-400 nt

8%

2.1

1 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

30-300 nt

10%

2.1

1.25 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

40-200 nt

12%

2.1

1.5 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

10-150 nt

15%

2.1

1.875 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

6-100 nt

20%

2.1

2.5 ml

0.5 ml

至體積5 ml

50 μl

5 μl

1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

1.4靜置10-20分鐘,待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后,說明凝膠已聚合。

注:凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

1.5去除覆蓋在分離膠上的水層;按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合;最后加入10%過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml,適用于1.0mm厚度膠)

各組份體積(ml

尿素

40%PAA29:1

10×TBE

RNase-free

10%APS

TEMED

0.84

0.2 ml

0.2 ml

補至體積2 ml

20 μl

2 μl

1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端;將梳子插入凝膠內(nèi),避免產(chǎn)生氣泡。

1.7常溫靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

注:凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

. 樣品制備:

2.1 取適量體積單鏈RNA Marker樣品與等體積的2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)混合,70℃處理5分鐘,冰浴制冷后待上樣。待測樣品也需要進行同樣處理。

.電泳:

3.1. 預(yù)電泳(可選):電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預(yù)電泳30分鐘。電泳結(jié)束后,1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次,去除殘余的尿素。

3.2.上樣:根據(jù)梳齒確定Marker上樣量, 一般是10齒1mm厚梳子Marker上樣5 μl,15齒1mm厚梳子上樣3 μl。

3.3. 連接電源線,打開電源開關(guān),按照以下條件電泳。

 

恒電壓

起始電流

結(jié)束電流

電泳時間

適用條件

推薦電壓

200V

15-20 mA/板膠

10-15 mA/板膠

60+ min

最佳電壓,最優(yōu)的分辨率

3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳,取出凝膠進行后續(xù)實驗。

變性膠濃度

溴酚藍

二甲苯菁

5%

35 nt

130 nt

8%

19 nt

75 nt

10%

15 nt

55 nt

15%

10 nt

52 nt

20%

5 nt

35 nt

四.染色:

單鏈RNA推薦用RealSafe Red(貨號:GR002)或RealSafe All(貨號:GR004)染色,兩種染料均可以得到清晰的條帶分離效果。

注:其余染料如GelRed,Goldview,EB等染色效果不好。

● 注意事項:

1. 單鏈RNA Marker產(chǎn)品適用于變性PAGE垂直電泳,不適用于水平瓊脂糖凝膠電泳。

2. 建議單鏈RNA Marker現(xiàn)用現(xiàn)配,因為混合有上樣緩沖液的單鏈RNA穩(wěn)定性不好。

3. ssRNA實驗樣品序列和實驗樣品上樣量的不同,顯示的片段大小與Marker可能會有微弱的差別。

● 電泳示例:

1. 使用RealSafe Red核酸染料(貨號:GR002)染色:

 

2. 使用核酸快速高靈敏度染色試劑盒(貨號:RTS5101)染色


 



 
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