單鏈DNA Marker（10-75 nt）非預混型                          

● 產品編號及規(guī)格：

● 產品簡介：

單鏈DNA Marker由不同長度的單鏈DNA分子混合而成，9條帶的大小為10，15，20，25，30，35，40， 50，75 nt。該產品不含有上樣緩沖液，可以根據實驗需求使用不同的上樣緩沖液，用于尿素變性電泳或非變性電泳。電泳后的PAGE膠可以使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe All（貨號：GR004）進行染色，均可以得到清晰的條帶分離效果。

產品附帶2×TBE尿素上樣緩沖液和2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液，方便待檢樣品的上樣。

配制好的即用型單鏈DNA Marker以每次上樣5 μl計算，該產品可以使用大約25次。

●  保存條件和運輸：

按照標簽溫度貯存；有效期2年；濕冰運輸。

● 使用方法：

一. 即用型單鏈DNA Marker（10-75 nt）配制方法：

1.1 進行尿素變性電泳：

1.2 進行非變性電泳：

 二. 凝膠制備：

注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請適當調整。

2.1 TBE-尿素凝膠制備：

2.1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制膠：

表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)

2.1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

2.1.3靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。

2.1.4去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產生氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)

2.1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內，避免產生氣泡。

2.1.6靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕h(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。

2.2非變性凝膠制備：

2.2.1可以選擇DNA非變性PAGE電泳試劑盒（貨號：RTE4101）或按照以下程序制膠。

2.2.2按照表三將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產生氣泡。

2.2.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

2.2.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合

表三 TBE-非變性PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。

2.2.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表四將不同體積成分在一個小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產生氣泡。

表四 TBE-非變性PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1.0mm厚度膠)

2.2.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內，避免產生氣泡。

2.2.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。

三. 樣品制備：

3.1 根據實驗目的，配制即用型單鏈DNA Marker樣品（步驟一）。單鏈DNA樣品使用尿素變性電泳，雙鏈DNA樣品使用非變性電泳，單鏈/雙鏈混合樣品使用非變性電泳。

四. 電泳：

4.1. 預電泳（可選）：電泳槽內外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預電泳30分鐘。電泳結束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。

4.2.上樣：根據梳齒確定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子上樣5 μl，15齒1mm厚梳子上樣3 μl。

4.3. 連接電源線，打開電源開關，按照以下條件電泳。

4.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)實驗。

五．染色：

用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的條帶分離效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe All（貨號：GR004）核酸染料結合單鏈核酸效果最佳，強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

六. 電泳示例：

6.1 使用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）染色：

15%尿素變性膠分離單鏈DNA

lane 1-9 為10，15，20，25，30，35，40，50，75 nt ssDNA 上樣量為0.5 μg

lane 10：RTM501，單鏈DNA Marker（20-75 nt）預混型，上樣量5 μl

lane 11：RTM507，單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預混型，配制后上樣量5 μl

lane 12：RTM509，單鏈DNA Marker（10-75 nt）預混型，配制后上樣量5 μl

電泳條件：1×TBE，恒壓200 V 50 min

染色：RealSafe Red后染20min，紫外激發(fā)

使用RTM501 單鏈DNA Marker（20-75 nt）發(fā)表部分文章列表：

1. [2021 IF=3.532] Real-time detection of SARS-CoV-2 in clinical samples via ultrafast ligation-dependent RNA transcription amplification

Marker :RTM501，單鏈DNA Marker（20-75 nt）

Author: Peng Zhang, Yang Li, Dongmei Zhang, Xinghao Zhu, Jinling Guo, Cuiping Ma and Chao Shi

Journal: Analytical Methods 2023, 15,1915

Institution： Qingdao University

Paper link：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D3AY00093A