● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

葉綠體（Chloroplast）是質(zhì)體的一種, 是高等植物和一些藻類(lèi)所特有的能量轉(zhuǎn)換器，是光合作用的反應(yīng)場(chǎng)所。在高等植物中葉綠體為雙凸或平凸透鏡，長(zhǎng)徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細(xì)胞一般含50～200個(gè)葉綠體，可占細(xì)胞質(zhì)的40%，葉綠體的數(shù)目因物種細(xì)胞類(lèi)型，生態(tài)環(huán)境，生理狀態(tài)而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類(lèi)囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、內(nèi)膜、類(lèi)囊體膜和3種彼此分開(kāi)的腔：膜間隙、基質(zhì)和類(lèi)囊體腔。本公司的植物葉綠體提取試劑盒采用密度梯度離心方法，可以從多種植物中提取高純度的葉綠體。

1. 即用型試劑盒，用戶(hù)不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 試劑盒可以用于葉綠體粗提，所得葉綠體含少量其他細(xì)胞器污染，可用于后續(xù)的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白組分析。也可以用于葉綠體精提，所得葉綠體完整，可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于葉綠體膜，基質(zhì)，類(lèi)囊體的提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化。

3. 以每次處理30 g葉片計(jì)算，本產(chǎn)品可使用8-10次提取，每次能得到3-5 mg左右葉綠體。

4. 已經(jīng)成功用于擬南芥，綠蘿，菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可能需要優(yōu)化條件）。

● 貯存及運(yùn)輸：

4-8℃保存，至少一年有效；試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 產(chǎn)品組成：

● 使用說(shuō)明：

注意：葉綠體對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取過(guò)程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

需要自備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離心管；15 ml尖底或圓底離心管；漏斗；勻漿機(jī)；低溫離心機(jī)。

1.1 材料預(yù)處理：

實(shí)驗(yàn)前1-2天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤(rùn)，即使如此，葉片采集后的放置時(shí)間也不能超過(guò)一天。

1.2  1×葉綠體提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個(gè)30克樣品提取反應(yīng)需要 150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈（約30克）并將葉片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在150 ml的預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加5 ml）。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉(zhuǎn)移到勻漿機(jī)（貨號(hào)：RT-2243A）中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿10秒，重復(fù)10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可，不要過(guò)分勻漿，否則會(huì)降低完整葉綠體的得率。

1.3.3 用2層過(guò)濾紙置于小漏斗上，將勻漿液過(guò)濾收集到預(yù)冷的250 ml量筒中，一般更換三次濾紙可收集約120 ml濾液，將濾液等分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過(guò)35 ml）。

1.4  離心去雜質(zhì)：

4℃ 200 g離心5分鐘，沉淀為未破裂植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞核，如果樣品中淀粉含量較高，沉淀可能為白色。（右圖）

注：此步驟用低速離心去除雜質(zhì)，不能省略，否則提取的葉綠體會(huì)有其他細(xì)胞器的污染。

1.5 收集葉綠體粗提液：

1.5.1將步驟1.4得到的上清液平分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml塑料離心管中。

1.5.2 4℃ 1100 g離心15分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體，呈深綠色（右圖）。

1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型），手彈離心管底部使葉綠體重懸，收集4管溶液（約6 ml），此溶液即為葉綠體粗提產(chǎn)物（含有破碎的葉綠體和完整的葉綠體），可直接用于后續(xù)的SDS-PAGE，Western，蛋白組分析。

注：重懸時(shí)最好避免溶液起泡，手指輕彈，不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。

1.6 完整葉綠體的純化：

葉綠體重懸液配制

1.6.1 單梯度分離法（適合菠菜，白菜，萵苣，擬南芥，綠蘿等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml離心管中加入6 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和4 ml密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度液，冰浴備用。

1.6.1.2將10 ml 40%密度梯度液平分到2個(gè) 15 ml離心管中，每管5 ml；將步驟1.5.3得到的葉綠體粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上；另一管重復(fù)。（5 ml 40%密度梯度液用可以分離3 ml 葉綠體粗提液，其他體積以此比例換算）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g離心15分鐘，綠色沉淀為完整葉綠體（右圖）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長(zhǎng)離心20分鐘。

1.6.1.4 小心棄上清，保留沉淀，每管沉淀中加入1 ml 葉綠體重懸液，輕柔重懸，可以收集到2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.2雙梯度分離法（適合煙草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml離心管中加入0.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml：

在另一15 ml離心管加入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一只15 ml離心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，隨后取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上，冰浴備用；然后取步驟1.5.3得到的3 ml葉綠體粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重復(fù)。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分離3 ml 葉綠體粗提液；其他體積按照比例調(diào)整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g離心15分鐘，上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體（右圖）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長(zhǎng)離心20分鐘。

1.6.2.5 重懸葉綠體：

用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（完整葉綠體）轉(zhuǎn)移到新的15 ml離心管中，加入三倍體積預(yù)冷的葉綠體重懸液，輕柔混勻。

1.6.2.6 離心收集葉綠體：

4℃ 1750 g離心6分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的0.5 ml葉綠體重懸液，手指輕彈管底使葉綠體重懸。最終可以收集到1 ml完整葉綠體溶液。

1.7 葉綠體貯存：

葉綠體可在顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體重懸液避光-80℃保存。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。所得精提葉綠體可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于葉綠體膜，基質(zhì)，類(lèi)囊體提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化實(shí)驗(yàn)等。

1.8 葉綠素含量測(cè)定：

通常葉綠體含量用單位葉綠素含量來(lái)表示，即x mg 葉綠素/ml 葉綠體懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.8.2 3000 g 離心5分鐘，取上清測(cè)定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮做空白對(duì)照。

1.8.3 根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀釋倍數(shù)

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

1.9 實(shí)驗(yàn)示例：

30克綠蘿葉片，加入150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）勻漿5×10秒，3次過(guò)濾共收集120 ml過(guò)濾液，平分4管，4℃ 1100 g 離心15 min，棄上清，每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中，共得到6 ml 葉綠體粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g離心15分鐘，棄上清，每管沉淀重懸于1 ml 葉綠體重懸液中，共得到2 ml精制葉綠體重懸液，測(cè)定葉綠素含量為3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得到6.86 mg葉綠體。取10 μl葉綠體溶液稀釋20倍，取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察，如右圖。

RTU5001 植物葉綠體提取試劑盒發(fā)表文章列表

1. [2022 IF=7.2] Sufficient potassium improves inorganic phosphate-limited photosynthesis in Brassica napus by enhancing metabolic P fractions and Rubisco activity.

實(shí)驗(yàn)植物：油菜

Author: Jinyao Yan, Xiaolei Ye, Yi Song, Tao Ren, Chongming Wang, Xiaokun Li, Rihuan Cong, Zhifeng Lu,Jianwei Lu.

Journal: The Plant Journal (2023) 113, 416–429

Institution：  Huazhong Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16057