植物葉綠體DNA提取試劑盒        

● 產(chǎn)品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質(zhì)體的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉(zhuǎn)換器，是光合作用的反應(yīng)場所。在高等植物中葉綠體為雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細(xì)胞一般含50～200個(gè)葉綠體，可占細(xì)胞質(zhì)的40%，葉綠體的數(shù)目因物種細(xì)胞類型，生態(tài)環(huán)境，生理狀態(tài)而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、內(nèi)膜、類囊體膜和3種彼此分開的腔：膜間隙、基質(zhì)和類囊體腔。

葉綠體DNA（Chloroplast DNA，cpDNA），存在于葉綠體內(nèi)，高等植物葉綠體的DNA為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子，其長度隨生物種類而不同，其大小在120 kb到217 kb之間，相當(dāng)于噬菌體基因組的大小雙鏈環(huán)狀，一個(gè)葉綠體含有10~50個(gè)cpDNA。

本試劑盒是結(jié)合植物葉綠體純化試劑盒和離心柱式植物DNA提取試劑盒而推出的新產(chǎn)品，專門用于植物葉綠體DNA的快速提取。

1. 純度高，不含污染和抑制劑，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各種后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2. 以每次處理30 g葉片計(jì)算，本產(chǎn)品可使用8-10次提取植物葉綠體，每次能得到3-5 mg左右葉綠體。按照每次使用0.2 ml 葉綠體溶液計(jì)算，可以至少提取50次葉綠體DNA的純化。cpDNA 產(chǎn)率一般在1-2 μg/1 g葉片樣品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段長度一般在40-50 Kb左右。

3. 已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等雙子葉植物，也適用于單子葉等其他植物（可能需要優(yōu)化條件）。

● 貯存及運(yùn)輸：

4-8℃保存，至少一年有效；試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 產(chǎn)品組成：

● 使用說明：

一 植物葉綠體提取：

注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在4℃預(yù)冷。葉綠體提取過程中離心時(shí)一定要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取過程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

需要自備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離心管；15 ml尖底或圓底離心管；漏斗；勻漿機(jī)；低溫離心機(jī)。

1.1 材料預(yù)處理：

實(shí)驗(yàn)前1-2天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集后的放置時(shí)間也不能超過一天。

1.2  1×葉綠體提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個(gè)30克樣品提取反應(yīng)需要 150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈（約30克）并將葉片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在150 ml的預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加5 ml）。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉(zhuǎn)移到勻漿機(jī)（貨號：RT-2243A）中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿10秒，重復(fù)10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可，不要過分勻漿，否則會(huì)降低完整葉綠體的得率。

1.3.3 用2層過濾紙置于小漏斗上，將勻漿液過濾收集到預(yù)冷的250 ml量筒中，一般更換三次濾紙可收集約120 ml濾液，將濾液等分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4 離心去雜質(zhì)：

4℃ 200 g離心5分鐘，保留上清，沉淀為未破裂植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞核（下圖）；如果樣品中淀粉含量較高，沉淀可能為白色。

注：此步驟用低速離心去除雜質(zhì)，不能省略，否則得到的葉綠體DNA中會(huì)有核基因組的污染。

1.5 收集葉綠體粗提液：

1.5.1將步驟1.4得到的上清液平分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml塑料離心管中；4℃ 1100 g離心15分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體，呈深綠色（下圖）。

1.5.2 在沉淀中加入1.5 ml 預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型），手彈離心管底部使葉綠體重懸，收集4管溶液（約6 ml），此溶液即為葉綠體粗提產(chǎn)物。

1.5.3 如果對葉綠體DNA是否含細(xì)胞核DNA的要求不高，則葉綠體粗提液可以直接用于葉綠體DNA純化（步驟2.1）。

1.6 完整葉綠體的純化：

葉綠體重懸液配制

1.6.1 單梯度分離法（適合菠菜，白菜，萵苣，擬南芥，綠蘿等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml離心管中加入6 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和4 ml密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度液，冰浴備用。

1.6.1.2將10 ml 40%密度梯度液平分到2個(gè) 15 ml離心管中，每管5 ml；將步驟1.5.2得到的葉綠體粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上；另一管重復(fù)。（5 ml 40%密度梯度液用可以分離3 ml 葉綠體粗提液，其他體積以此比例換算）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g離心30分鐘，綠色沉淀為完整葉綠體（下圖）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長離心20分鐘。

1.6.1.4 小心棄上清，保留沉淀，每管沉淀中加入1 ml 葉綠體重懸液，輕柔重懸，可以收集到2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.1.5 此葉綠體溶液可以提取得到無細(xì)胞核DNA污染的葉綠體DNA  

（步驟2.1）。

1.6.2雙梯度分離法（適合煙草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml離心管中加入0.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml：

在另一15 ml離心管加入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一只15 ml離心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，隨后取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上，冰浴備用；然后取步驟1.5.2得到的3 ml葉綠體粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重復(fù)。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分離3 ml 葉綠體粗提液；其他體積按照比例調(diào)整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g離心30分鐘，上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體（下圖）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長離心20分鐘。

1.6.2.5 重懸葉綠體：

用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（完整葉綠體）轉(zhuǎn)  移到新的15 ml離心管中，加入三倍體積預(yù)冷的葉綠體重懸液，輕柔混勻。

1.6.2.6 離心收集葉綠體：

4℃ 1750 g離心6分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的1 ml葉綠體重懸液，手指輕彈管底使葉綠體重懸。最終可以收集到2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.2.7此葉綠體溶液可以提取得到無細(xì)胞核DNA污染的葉綠體DNA（步驟2.1）。

1.7 葉綠體貯存：

葉綠體可在顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體重懸液避光-80℃保存。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

1.8 葉綠素含量測定：

通常葉綠體含量用單位葉綠素含量來表示，即x mg 葉綠素/ml 葉綠體懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.8.2 3000 g 離心5分鐘，取上清測定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮做空白對照。

1.8.3 根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀釋倍數(shù)

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

二 葉綠體DNA提取：

注：以下離心操作可以常溫下進(jìn)行。

2.1 取0.2-0.4 ml葉綠體溶液，3500 g離心2分鐘，小心棄上清，沉淀為葉綠體。

   注：可以根據(jù)提取的葉綠體濃度大體估算提取到的cpDNA濃度。經(jīng)驗(yàn)值：每50 μg 葉綠體（葉綠素濃度）可以提取到1μg cpDNA。

2.2葉綠體沉淀中加入400 μl 緩沖液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩渦震蕩1分鐘。

2.3 將離心管放在65℃水浴10分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。

2.4 加入130 μl 緩沖液AP2，顛倒混勻，冰浴5分鐘。

2.5 12,000 rpm離心5分鐘，保留上清，上清通常為無色，沉淀為綠色。注：此步驟離心去除去垢劑，蛋白以及多糖等雜質(zhì)。

2.6 將上清（通?？扇〉?00 μl）轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，加入1.5倍體積（例如400 μl的上清液加600 μl）緩沖液AP3（使用前請注意是否已經(jīng)加入無水乙醇），立即顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

2.7吸取步驟2.6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：離心吸附柱的最大容積是700 μl，如果一次不能完全上柱，可以分次上柱離心，保證全部溶液全部加到離心柱中。

2.8向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

2.9向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

2.10將吸附柱CG放回廢液收集管中，12,000 rpm離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。

2.11將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100 μl經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000 rpm g離心2分鐘。

注：洗脫緩沖液體積不要少于50 μl，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

2.12  葉綠體DNA產(chǎn)物-20℃保存。

三 實(shí)驗(yàn)示例：

3.1 葉綠體提取示例：

30克綠蘿葉片，加入150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）  勻漿5×10秒，3次過濾共收集120 ml過濾液，平分4管，4℃ 1100 g 離心15 min，棄上清，每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中，共得到6 ml 葉綠體粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g離心15分鐘，棄上清，每管沉淀重懸于1 ml 葉綠體重懸液中，共得到2 ml精制葉綠體重懸液，測定葉綠素含量為3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得到6.86 mg葉綠體。取10 μl葉綠體溶液稀釋20倍，取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察，如下圖。

3.2 葉綠體DNA電泳示例：

葉綠體提取同3.1。取100 μl葉綠體重懸液，提取cpDNA，最后用50 μl洗脫，上樣5 μl，電泳結(jié)果見下圖左二泳道，cpDAN大小約20kb，無可見核基因組污染。