Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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WS1080-100ml
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Western一抗二抗去除液（弱堿性，劇烈型）
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100 ml
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● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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WS1080-01
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Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
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100 ml
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RT
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WS1080-02
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增強(qiáng)劑
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1 ml
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4℃（配成溶液后-20℃貯存）
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
Western抗體去除液（中性，劇烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，neutral，harsh type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影響，用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白的膜的重復(fù)利用，可以轉(zhuǎn)一次膜，做多次Western印跡實驗，通?？梢灾貜?fù)利用膜2-3次。使用本試劑只需大約20-30分鐘即可實現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用，然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。以每次使用5 ml Western抗體清除液計算，本產(chǎn)品可以使用20次。
該產(chǎn)品具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：
1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；
2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；
3.有利于對異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn)；
4.有利于糾正孵錯的抗體；
5.節(jié)約試劑成本，并節(jié)約時間。
各種去除液的選擇請點(diǎn)擊Western一抗二抗去除液選擇指南。
● 貯存：
按照標(biāo)簽溫度貯存，有效期一年；常溫運(yùn)輸。
● 用前必讀：
1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時，不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì)，但是目前沒有一種去除液可以做到只洗脫抗體，而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原；也沒有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng)，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高。因此，從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途，因為在每個抗體清除循環(huán)中，或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。
2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實驗。
3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實驗。在第一輪抗體檢測之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪ECL發(fā)光檢測實驗后，需要用清除液清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。
4. 檢測時，優(yōu)先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達(dá)較低）的蛋白，再孵育條帶明顯（表達(dá)較高）的蛋白，最后再孵育內(nèi)參。
5. 如條件允許，下一輪的抗體雜交實驗選擇種屬來源不同的一抗（對應(yīng)不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應(yīng)。
6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒光檢測。
● 使用說明：
1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測后，NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復(fù)漂洗2次；1×TBST漂洗一次。
2. 棄1×TBST，加入適量的Western一抗二抗去除液和1/100體積的增強(qiáng)劑（例如使用5 ml去除液，加50 μl 增強(qiáng)劑）；在搖床上震蕩漂洗20-30分鐘（轉(zhuǎn)速70 -80
rpm）。
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操作溫度
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震蕩清除時間
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備注
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18℃
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40-60分鐘
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冬天實驗室氣溫低時
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25℃
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約30分鐘
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常規(guī)樣品操作
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50℃
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15-20分鐘
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膜上蛋白含量高的樣品或清除與膜親和力高的抗體
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3. 棄去除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分鐘，把去除液徹底漂洗干凈。
注：殘余的去除液會影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。
4. 可選步驟：漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液，檢測二抗的清除效率。曝光5分鐘，膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶，重復(fù)步驟2-3。
5．繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作（封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測）。
注：建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉，以降低背景。
● 實驗示例：
Western一抗二抗去除液檢測效果圖
樣品：293細(xì)胞，Ball-1細(xì)胞總蛋白(TP)，胞漿蛋白(C-Pr)，核蛋白(N-Pr)
電泳條件：12% SDS-PAGE（貨號:RTD6132） 200
V 1×TGS 53 min
轉(zhuǎn)膜條件：NC膜，1×RealBlot
恒流400 mA 35 min
封閉：無蛋白快速封閉液
RT 60 min
一抗：TBP鼠單抗
1:5000 RT 60min孵育(圖一)
GAPDH兔多抗
1:2000 RT 60 min孵育(圖三)
二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min(圖一)
羊抗兔IgG-HRP
1:5000 RT 60 min (圖三)
抗體去除：NC膜蒸餾水漂洗3次，加入5 ml抗體去除液和50 μl
增強(qiáng)劑，常溫，搖床 30 min
ECL曝光5分鐘（圖二），ECL曝光2秒（圖一，圖三）