細胞增殖-毒性檢測試劑盒

Cell Counting Kit-8(CCK-8)

● 產品組成：

●  產品簡介：

CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8是一種類似于 MTT的化合物，在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被還原生成橙黃色水溶性的甲臜（Formazan）。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。

WST-8與傳統(tǒng)的MTT，XTT，MTS，WST-1相比有明顯的優(yōu)點。首先，反應生成的formazan是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8更加穩(wěn)定，檢測線性范圍更寬，靈敏度更高。

本試劑盒可以用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。

本試劑盒檢測便捷，使用方便。僅含一管已經配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟去溶解甲臜。特別適用于大批量樣品的檢測。

另外，酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。

WST-8對細胞無明顯毒性。加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀板，使檢測時間更加靈活，便于找到最佳測定時間。

本試劑盒可以測定100個或500個樣品。

●  保存條件：

CCK-8 溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年，如長期保存，可在-20℃下保存 2 年，如需經常使用請將試劑存放在 0-5℃，為防止背景值增加干擾實驗結果，請勿反復凍融。

● 操作步驟：

1.  在 96孔板中接種細胞懸液(100 μl /孔)，通常細胞增殖實驗每孔約2000 個細胞，細胞毒

性實驗每孔約5000 個細胞，具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定)。

2.  按照實驗需要，進行培養(yǎng)并給予0-10 μl特定的藥物刺激，處理一段適當的時間(例如: 6,12,

24或48小時)。

3.  每孔加入10 μl CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為200 μl，則需加入20 μl CCK-8溶液，以此類推?？梢杂眉酉鄳考毎囵B(yǎng)基和 CCK-8但不加細胞的孔作為空白對照，若擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和 CCK-8 溶液但不加細胞的孔作為空白對照。

4.  在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育1-4小時，具體時間可以通過預實驗確定。預實驗時可以在0.5、

2和4 小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。

5.  用酶標儀測定在450 nm處的吸光值，若無450nm濾光片，可以使用420-480nm 的濾光

片。如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，可以使用大于 600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

6.  如果需要暫時不測定 OD值，可以向每孔中加入10 μl0.1MHCl 溶液或者1%(w/v)的 SDS溶液，避光保存在室溫，24 小時內吸光度不會發(fā)生變化。  

● 注意事項：

1.  使用96 孔板進行檢測時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，請注意蒸發(fā)問題。可將96 孔板外圍一圈加培養(yǎng)基、水或 PBS保濕。同時，可以把96孔板置于培養(yǎng)箱內靠近水盤的位置以緩解蒸發(fā)。

2.  培養(yǎng)時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而不同。在正式實驗前，建議先做預實驗摸索鋪板的細胞數量以及加入CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間。

3.  鋪板時請注意保證每個孔細胞數量均勻，建議鋪板過程中注意時常混勻，防止因細胞沉淀造成不均勻。加入CCK-8 后請前后左右輕輕晃動培養(yǎng)板數次，使培養(yǎng)基和CCK-8 溶液充分混勻。

4.  本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，如果待測物質有氧化性或還原性，可在加CCK-8  之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。若藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

5.  加入CCK-8 時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

6.  用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。

7.  本試劑盒系無菌灌裝生產。在使用過程中，請在生物安全柜內無菌操作，避免污染。

CCK-8

使用該產品發(fā)表部分文章列表：

1. [2022 IF=2.6] Upregulation of Protease-Activated Receptor 2 Promotes Proliferation and Migration of Human Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs).

Author: Mei Wei, Yongsheng Liu, Mingqi Zheng, Le Wang, Fangfang Ma, Yanchao Qi, Gang Liu

Journal: Medicine Science Monotor. 2019; 25: 8854-8862

Institution：The First Hospital of Hebei Medical University

Paper link：https://www.medscimonit.com/abstract/index/idArt/917865