5% TBE-尿素-PAGE制膠液（核酸變性電泳）
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTE4104-5
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5% TBE-尿素-PAGE制膠液(核酸變性電泳)
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200 ml
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● 產(chǎn)品組成：
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序號
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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保存條件
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1
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RTE4104-10-1
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5% TBE-尿素-PAGE制膠液
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200 ml
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4℃
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2
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AP020P
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APS（干粉）
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5 ml
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RT (配制后-20℃貯存)
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3
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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4
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
核酸尿素 PAGE 電泳是研究寡核苷酸和小RNA電泳的重要研究手段。可以檢測2-500堿基的寡核苷酸或RNA片段，理論上可以分辨出相差一個核苷酸的片段。
本公司提供的TBE-尿素-PAGE制膠液為一瓶即用型試劑，包含尿素，凝膠聚合溶液和TBE緩沖液，使用時只需取適量制膠液，隨后加入催化劑即可配制成固定濃度的TBE-尿素-PAGE凝膠，使用方便。
根據(jù)下表選擇合適的凝膠濃度：
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推薦分離范圍 nt
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TBE-尿素-PAGE濃度
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溴酚藍(lán)
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二甲苯菁
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200-1000
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5%
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~35 nt
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~130 nt
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50-400
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8%
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~19 nt
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~75 nt
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40-350
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10%
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~15 nt
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~55 nt
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30-300
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12%
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~12 nt
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~55 nt
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10-150
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15%
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~10 nt
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~52 nt
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8-120
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20%
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~5 nt
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~50 nt
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按照每次制備7 ml 凝膠（大小10×8cm，1mm厚度）計算，該制膠液可以至少制備25塊5%TBE-尿素-PAGE凝膠。
如果進行RNA電泳實驗，建議使用RNase-free水配制相關(guān)溶液，避免RNA的降解。
● 貯存和運輸：
按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期6個月；試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
一、制備凝膠：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml 滅菌水或RNase-free水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少常溫存放時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時間延長，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10% APS。
1.1．參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2．凝膠配制：將不同體積的成分混合。
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5%TBE-尿素-PAGE凝膠
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總體積7 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠
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5% TBE-尿素-PAGE制膠液
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7 ml
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10%APS
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50-70 μl
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TEMED
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5-7 μl
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1.3將配制好的膠液加入到玻璃板中，在膠的液面到達(dá)頂部時停止灌膠，插入梳子。
1.4 靜置25-40 分鐘。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。凝膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
二、電泳：
2.1. 預(yù)電泳（可選）：
拔出梳子，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘余的尿素。電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200 V預(yù)電泳30分鐘。
注：1×TBE配方如下：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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89
mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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10.8 克
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54克
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2
mM
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2
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EDTA
2Na·2H2O [MW372.24]
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0.744 克
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3.72克
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89
MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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5.5 克
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27.5克
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4
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蒸餾水或RNase-free水最后定容至
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1 升
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5 升
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最后pH在8.2-8.3之間，可以不用調(diào)節(jié)pH，記錄每批pH
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2.2. 取 3-5
μl樣品，加入等體積2×TBE尿素上樣緩沖液（貨號：DL080），70℃處理5分鐘后立即冰浴，上樣。
2.3. 連接電源線，打開電源開關(guān)，按照以下條件電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
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適用條件
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推薦電壓
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200V
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15-20
mA/板膠
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8-15
mA/板膠
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50+
min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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2.4. 根據(jù)下表溴酚藍(lán)指示前沿位置判斷條帶位置，取出凝膠進行后續(xù)實驗。
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變性膠濃度
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溴酚藍(lán)
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二甲苯菁
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5%
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~35 nt
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~130 nt
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8%
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~19 nt
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~75 nt
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10%
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~15 nt
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~55 nt
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12%
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~12 nt
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~55 nt
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15%
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~10 nt
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~52 nt
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20%
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~5 nt
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~50 nt
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三、染色（RealSafe核酸染料染色）：
3.1染色液配制：取一合適的塑料容器，加入100 ml 1×TBE，隨后加入10 μl RealSafe核酸染料（貨號：GR002）混勻。
3.2 染色：取下凝膠放入染色液中，常溫下?lián)u床輕輕地?fù)u動凝膠染色，最佳的染膠時間為15-20 分鐘，這取決于凝膠的厚度、聚丙烯酰胺的濃度和核酸的長短。凝膠越厚或聚丙烯酰胺的濃度越高，染色所需要的時間就越長。注：染色溶液至少可重復(fù)使用2-3次。如果不立即再用的話，建議將用過的染色溶液冷藏避光保存。
3.3 觀察：紫外燈下觀察條帶。
● 實驗示例：