細菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號：RTG2401）

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲存、效期及運輸：

本試劑盒在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長時間的保存可置于2-8℃。2-8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的蛋白酶K、溶菌酶和RNaseA收到后-20℃保存。

蛋白酶K、溶菌酶和RNase A濕冰運輸，其余組份常溫運輸。

● 產(chǎn)品簡介：

本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)提取細菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌）的基因組DNA。溶菌酶能有效去除細菌細胞壁；蛋白酶K能把核酸解離出來； RNaseA能去除痕量的RNA污染；離心吸附柱能夠高效、專一吸附DNA，最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物，提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實驗。

● 提取得率：

● 準備工作：

1. 準備55℃和70℃水??；無水乙醇；1.5 ml滅菌離心管。

2. 按照標簽所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?

3. 每次使用前請檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1. 取細菌培養(yǎng)液1-2 ml，10,000 g離心1分鐘，盡量吸凈上清；向細菌沉淀中加入180 μl EB，旋渦混勻后加入18 μl 溶菌酶，室溫放置10-15分鐘，期間間歇混勻幾次。

注：溶菌酶的用量和處理時間與處理的細菌種類密切相關(guān)，用戶可以根據(jù)細菌種類進行調(diào)節(jié)。如革蘭氏陽性菌應(yīng)將處理時間延長到30-60分鐘。

2.10,000g離心1分鐘，吸棄大部分上清，留下約10 μl液體，徹底混勻。

   注：由于余留的液體較少，徹底混勻菌體不太容易，用手指彈動管壁附加槍頭反復(fù)吹打既能完全混勻菌體。混勻一定要徹底，否則容易導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。

3. 向菌體沉淀中加入200 μl緩沖液GA，混勻。

4. 向管中加入20 μl 蛋白酶K，混勻，55℃處理15-30分鐘，期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。

   注：加入蛋白酶K后會產(chǎn)生絮狀物，消化徹底的標志是絮狀物完全消失，溶液變清亮。如消化不徹底，會導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。

5. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

6. 加入220 μl緩沖液GB，混勻，70℃放置10-30分鐘（對于革蘭氏陽性菌，時間應(yīng)延長到60分鐘）。

注：加入緩沖液GB時可能會產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置相應(yīng)時間后溶液會變清亮。如溶液未變清亮，應(yīng)延長70℃處理時間。如果絮狀物不能處理干凈，容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。

7. 加入220 μl無水乙醇，充分混勻。

注：加入乙醇后會產(chǎn)生絮狀沉淀，可用槍頭反復(fù)抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理，容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。

8. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g離心5分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

注：如果出現(xiàn)吸附柱堵塞現(xiàn)象，可將離心時間延長到10分鐘。

9. 向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11,000 g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11,000 g離心60秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW，11,000 g離心60秒，倒掉廢液。

12. 吸附柱CG放回收集管中，11,000 g離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。

13. 將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5 ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11,000 g離心2分鐘。

注； = ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過小影響回收效率。

=  ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

14. DNA產(chǎn)物-20℃保存。

● DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23 kb以上。使用分光光度計檢測時， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)為1.7-1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。

RTG2401 細菌基因組DNA提取試劑盒發(fā)表文章

1. [2022 IF=4.2] Screening of high-efciency nitrogen-fxing bacteria from the traditional Chinese medicine plant Astragalus mongolicus and its efect on plant growth promotion and bacterial communities in the rhizosphere.

Author: Zhiyong Shi, Xu Guo, Zhenhong Lei, Yuanyuan Wang, Zhenyu Yang, Jingping Niu and Jianping Liang

Product: RTG2401 細菌基因組DNA提取試劑盒

Journal: BMC Microbiology    (2023) 23:292

Institution： College Of Life Sciences，Shanxi Agricultural University

Paper link：https://doi.org/10.1186/s12866-023-03026-1

2. [2022 IF=4] Analysis of the improved mechanism of Rhodobacter sphaeroides VK-2-3 coenzyme Q10 by reverse metabolic engineering.

Author: Long Zhang, Le-yi Wang, Yi-jun Han, Yan-xin Liu, Yong-li Li, Jian-hua Hu, Zhi-jie Tian，Zhan-ying Liu

Product: RTG2401 細菌基因組DNA提取試劑盒

Journal: Frontiers in Microbiology  published  04 July 2024

Institution： College of Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Technology

Paper link： https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2024.1410505/full