2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
● 產(chǎn)品包裝：
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組成
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RTQ3101-02
(可做40次50 μl反應(yīng))
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RTQ3101-03
(可做200次50 μl反應(yīng))
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RTQ3101-04
(可做1000次50 μl反應(yīng))
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長期貯存
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2×SYBR qPCR MasterMix
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1ml
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5×1ml
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25×1ml
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-20℃
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RNase-free water
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1 ml
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5×1 ml
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25×1 ml
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-20℃
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注：以50μl qPCR反應(yīng)體系為例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反應(yīng)。
● 儲(chǔ)存條件: -20℃避光保存；經(jīng)常使用時(shí)，一旦融化后請4℃貯存，4℃保存至少3個(gè)月；盡量避免反復(fù)凍融。
● 產(chǎn)品簡介：
本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑。已經(jīng)將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩(wěn)定劑、優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預(yù)混成一種適合 Real Time PCR反應(yīng)檢測用 2×MasterMix試劑，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶，并結(jié)合精心優(yōu)化的反應(yīng) Buffer，從而有效抑制低溫下的非特異性擴(kuò)增，提高反應(yīng)特異性和擴(kuò)增效率，能夠在更寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。使用時(shí)只需加入模板、引物和水，便可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，重復(fù)性好，可信度高。
預(yù)混液中含有優(yōu)化的校正染料，與一系列qPCR設(shè)備兼容，包括需要ROX校正的儀器，實(shí)驗(yàn)操作過程中不需要額外添加校準(zhǔn)染料來校正儀器。
● 注意事項(xiàng)
1. 本制品中已經(jīng)含有優(yōu)化的校正染料，客戶無需再添加校正染料，可以直接使用。
2. 本制品含SYBR® Green I，強(qiáng)光下易分解，使用時(shí)避免長時(shí)間強(qiáng)光照射本制品。
3. 建議在冰上配制qPCR反應(yīng)液，再放入qPCR儀器中擴(kuò)增?？梢蕴岣邤U(kuò)增特異性，減少背景。
4.-20℃下保存時(shí)間較長，有微量沉淀產(chǎn)生，充分混勻后不影響使用。本制品已經(jīng)優(yōu)化了反應(yīng)緩沖液中的Mg2+濃度，無需再調(diào)節(jié)Mg2+濃度。
5. 模板DNA：用本產(chǎn)品，cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時(shí)請注意模板量對PCR擴(kuò)增的影響。本產(chǎn)品建議添加量為：cDNA添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%；基因組DNA為模板時(shí)，為避免在高濃度區(qū)域出現(xiàn)線性差的情況，請注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可作為PCR模板，添加時(shí)請以300 ng為上限；由于質(zhì)粒DNA濃度和拷貝數(shù)很高，在添加PCR模板之前最好進(jìn)行稀釋梯度試驗(yàn)，以便確定合適的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。
6. 引物：
建議每條引物工作濃度200 nM-800 nM；為得到高靈敏度定量性的數(shù)據(jù)，引物的設(shè)計(jì)非常重要。以下列舉了設(shè)計(jì)引物時(shí)需注意的一般事項(xiàng)。
a) 引物長度請?jiān)O(shè)定為18bp～30bp、GC含量為40%～65%；
b) 擴(kuò)增片段一般小于300bp，請盡量設(shè)定在80bp～150bp。過長的片段容易導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低；
c) 如設(shè)計(jì)mRNA為目的片段的引物，設(shè)計(jì)應(yīng)盡量橫跨內(nèi)含子，以防止基因組DNA的擴(kuò)增而引起假陽性；
d) 請盡量選擇Tm為65℃～67℃；
e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich或AT rich（特別是3'端）。避開T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續(xù)結(jié)構(gòu)；
f) 避開引物內(nèi)部或兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。二條引物間的3'末端避開有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；
g) 引物設(shè)計(jì)完成后要使用BLAST檢索確認(rèn)引物的特異性。
此外，引物的純化純度對反應(yīng)特異性有很大的影響。經(jīng)過一般純化、純度較低的引物熒光強(qiáng)度散亂，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，致使熔解曲線出現(xiàn)雜峰。請盡可能使用HPLC級別純化，至少要用經(jīng)Cartridge(OPC)級別以上純化的引物。
7. 對照設(shè)計(jì)：
1）No template control（NTC）：在qPCR反應(yīng)體系中僅僅缺少模板。用以檢測有無二聚體和試劑有無污染。
2）Reverse Transcripase control：用以評估逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中有無基因組DNA的污染。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中僅僅不含有逆轉(zhuǎn)錄酶。
● 使用說明：
1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix，避免渦旋震蕩，以免產(chǎn)生過多氣泡，徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。
2. 按照下表在制備反應(yīng)體系：
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50 μl反應(yīng)體系
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20 μl反應(yīng)體系
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終濃度
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2×qPCR MasterMix
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25 μl
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10 μl
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1×
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上游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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下游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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模板
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× μl
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x μl
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10pg-100ng
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水
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補(bǔ)至50 μl
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補(bǔ)至20 μl
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3. 快甩離心將反應(yīng)液收集到管底。
4. 檢測片段大于300 bp，qPCR儀上推薦執(zhí)行以下程序（三步法）：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數(shù)
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火
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55-65℃
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30 sec
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延伸
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72℃
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30 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器默認(rèn)采集程序
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檢測片段小于300 bp，qPCR儀上推薦執(zhí)行以下程序（兩步法）：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數(shù)
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火和延伸
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60℃
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60 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器默認(rèn)采集程序
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注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經(jīng)過抗體修飾的，初始變性95℃30 sec即可。
● 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
反應(yīng)結(jié)束后加做融解曲線，以區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物及引物二聚體。根據(jù)擴(kuò)增曲線和融解解曲線結(jié)果可進(jìn)行PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。
● 常見問題及處理
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問題
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可能原因
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推薦的解決方法
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無擴(kuò)增曲線且無擴(kuò)增產(chǎn)物（凝膠電泳）
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反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制劑
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更換或純化模板DNA。
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引物設(shè)計(jì)不合理
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重新設(shè)計(jì)、合成引物。
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逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物體積過量
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減少逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量以不超過反應(yīng)體系的10%。
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加樣錯(cuò)誤或有試劑未加
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檢查是否加了所有的所需試劑。
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引物的降解
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通過PAGE電泳檢測引物完整性。
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退火溫度不正確
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優(yōu)化退火溫度。
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無擴(kuò)增曲線但有擴(kuò)增產(chǎn)物（凝膠電泳）
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qPCR儀設(shè)置不正確
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檢查dye selction，reference dye是否選擇正確
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失效的熒光檢測
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熒光檢測應(yīng)在PCR循環(huán)的退火/延伸階段。
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熒光PCR儀問題
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參考qPCR儀器說明書
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陰性對照（NTC）有擴(kuò)增曲線
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反應(yīng)體系中有污染
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qPCR片段較小，極易造成環(huán)境中氣溶膠污染。如果融解曲線分析，解鏈溫度和目的片段相同，凝膠電泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，極有可能是反應(yīng)體系中某一或某些試劑污染所引起的。建議換至沒有污染源的環(huán)境進(jìn)行PCR體系的配制。
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引物二聚體
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進(jìn)行溶解曲線分析，如果擴(kuò)增曲線的解鏈溫度小于80℃，凝膠電泳片段大小和目的片度不符。請重新設(shè)計(jì)引物。
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提高退火溫度3℃。
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PCR效率高于110%
(斜率>-3.1）
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有非特異性擴(kuò)增
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溶解曲線分析非特異性擴(kuò)增；優(yōu)化引物設(shè)計(jì)
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PCR擴(kuò)增效率低于90%
(斜率<-3.6)
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反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制劑
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更換或純化模板DNA
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PCR擴(kuò)增條件不合適引起擴(kuò)增效率降低。
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確認(rèn)引物濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。
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引物設(shè)計(jì)
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重新設(shè)計(jì)引物，避免擴(kuò)增區(qū)域的DNA二級結(jié)構(gòu)。
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實(shí)時(shí)熒光曲線線性不好
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模板DNA含量較低或過高
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應(yīng)調(diào)整樣品的DNA濃度。
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模板DNA中含有抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)
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對模板DNA進(jìn)行純化或更換模板。
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質(zhì)量不好的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成的cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中所含的物質(zhì)可能抑制PCR反應(yīng)。
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請降低樣品濃度，或?qū)悠芳兓笤龠M(jìn)行反應(yīng)。建議使用品牌質(zhì)量較好的cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。
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CT值高于預(yù)期值
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加入的模板量太少
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適當(dāng)增加模板量。
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樣品被降解
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檢查樣品的完整性。
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引物不合適
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重新設(shè)計(jì)合成引物。
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CT值低于預(yù)期值
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加入了過多的模板
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減少模板量。
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PCR產(chǎn)物太長
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一般采用100-150bp的產(chǎn)物長度，一般不超過500bp
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CT值的標(biāo)準(zhǔn)差>0.16
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取樣不準(zhǔn)確
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每種樣品的反應(yīng)混合液單獨(dú)配制，充分混勻；
qPCR之前要離心，管壁不要沾有反應(yīng)液。
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ΔRn值太小
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PCR效率太低
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優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。
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目標(biāo)模板數(shù)太低
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增加模板量。
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擴(kuò)增曲線的熒光信號弱，或擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀
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PCR的延伸時(shí)間過短即熒光讀取時(shí)間不充分，熒光收集不能充分完成。
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適當(dāng)增加延伸時(shí)間。
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以少于PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)條件的反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增，熒光收集量的誤差會(huì)增大
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應(yīng)增加反應(yīng)體積以滿足PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)。
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