2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）

● 產(chǎn)品包裝： 

注：以50μl qPCR反應(yīng)體系為例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反應(yīng)。

● 儲(chǔ)存條件: -20℃避光保存；經(jīng)常使用時(shí)，一旦融化后請(qǐng)4℃貯存，4℃保存至少3個(gè)月；盡量避免反復(fù)凍融。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本制品是采用SYBR^® Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑。已經(jīng)將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩(wěn)定劑、優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液和 SYBR^® Green I 等試劑預(yù)混成一種適合 Real Time PCR反應(yīng)檢測(cè)用 2×MasterMix試劑，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。

本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶，并結(jié)合精心優(yōu)化的反應(yīng) Buffer，從而有效抑制低溫下的非特異性擴(kuò)增，提高反應(yīng)特異性和擴(kuò)增效率，能夠在更寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。使用時(shí)只需加入模板、引物和水，便可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，重復(fù)性好，可信度高。

預(yù)混液中含有優(yōu)化的校正染料，與一系列qPCR設(shè)備兼容，包括需要ROX校正的儀器，實(shí)驗(yàn)操作過程中不需要額外添加校準(zhǔn)染料來校正儀器。

● 注意事項(xiàng)

1. 本制品中已經(jīng)含有優(yōu)化的校正染料，客戶無需再添加校正染料，可以直接使用。

2. 本制品含SYBR^® Green I，強(qiáng)光下易分解，使用時(shí)避免長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)光照射本制品。

3. 建議在冰上配制qPCR反應(yīng)液，再放入qPCR儀器中擴(kuò)增?？梢蕴岣邤U(kuò)增特異性，減少背景。

4.-20℃下保存時(shí)間較長(zhǎng)，有微量沉淀產(chǎn)生，充分混勻后不影響使用。本制品已經(jīng)優(yōu)化了反應(yīng)緩沖液中的Mg²⁺濃度，無需再調(diào)節(jié)Mg²⁺濃度。

5. 模板DNA：用本產(chǎn)品，cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時(shí)請(qǐng)注意模板量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。本產(chǎn)品建議添加量為：cDNA添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%；基因組DNA為模板時(shí)，為避免在高濃度區(qū)域出現(xiàn)線性差的情況，請(qǐng)注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可作為PCR模板，添加時(shí)請(qǐng)以300 ng為上限；由于質(zhì)粒DNA濃度和拷貝數(shù)很高，在添加PCR模板之前最好進(jìn)行稀釋梯度試驗(yàn)，以便確定合適的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。

6. 引物：

建議每條引物工作濃度200 nM-800 nM；為得到高靈敏度定量性的數(shù)據(jù)，引物的設(shè)計(jì)非常重要。以下列舉了設(shè)計(jì)引物時(shí)需注意的一般事項(xiàng)。

a) 引物長(zhǎng)度請(qǐng)?jiān)O(shè)定為18bp～30bp、GC含量為40%～65%；

b) 擴(kuò)增片段一般小于300bp，請(qǐng)盡量設(shè)定在80bp～150bp。過長(zhǎng)的片段容易導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低；

c) 如設(shè)計(jì)mRNA為目的片段的引物，設(shè)計(jì)應(yīng)盡量橫跨內(nèi)含子，以防止基因組DNA的擴(kuò)增而引起假陽性；

d) 請(qǐng)盡量選擇Tm為65℃～67℃；

e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich或AT rich（特別是3'端）。避開T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續(xù)結(jié)構(gòu)；

f) 避開引物內(nèi)部或兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。二條引物間的3'末端避開有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；

g) 引物設(shè)計(jì)完成后要使用BLAST檢索確認(rèn)引物的特異性。

此外，引物的純化純度對(duì)反應(yīng)特異性有很大的影響。經(jīng)過一般純化、純度較低的引物熒光強(qiáng)度散亂，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，致使熔解曲線出現(xiàn)雜峰。請(qǐng)盡可能使用HPLC級(jí)別純化，至少要用經(jīng)Cartridge(OPC)級(jí)別以上純化的引物。

7. 對(duì)照設(shè)計(jì)：

1）No template control（NTC）：在qPCR反應(yīng)體系中僅僅缺少模板。用以檢測(cè)有無二聚體和試劑有無污染。

2）Reverse Transcripase control：用以評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中有無基因組DNA的污染。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中僅僅不含有逆轉(zhuǎn)錄酶。

●  使用說明：

1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix，避免渦旋震蕩，以免產(chǎn)生過多氣泡，徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。

2. 按照下表在制備反應(yīng)體系：

3. 快甩離心將反應(yīng)液收集到管底。

4. 檢測(cè)片段大于300 bp，qPCR儀上推薦執(zhí)行以下程序（三步法）：

檢測(cè)片段小于300 bp，qPCR儀上推薦執(zhí)行以下程序（兩步法）：

注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經(jīng)過抗體修飾的，初始變性95℃30 sec即可。

● 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后加做融解曲線，以區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物及引物二聚體。根據(jù)擴(kuò)增曲線和融解解曲線結(jié)果可進(jìn)行PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

● 常見問題及處理